Биология размножения

[Ольга Шаронова]

В настоящее время накоплен довольно большой материал по биологии размножения кошки. Эти данные представляются важными для практики разведения породистых кошек. Однако особое значение они имеют для работ по экспериментальной эмбриологии кошки, исследований в области трансгенеза, разработки методов криоконсервации зародышей.
СЕЗОHHОСТЬ РАЗМHОЖЕHИЯ

В ходе доместикации произошло значительное изменение ряда физиологических функций домашней кошки, в том числе и такой важной для приспособленности функции, как размножение. Дикая европейская кошка размножается только один раз в году, причем в строго определенное время года, тогда как домашняя кошка может приносить до трех пометов в год. Величина помета у домашних кошек также значительно больше. Если у диких кошек число котят в помете 1-2, то у домашних 5-6.
Половой зрелости самки домашней кошки достигают в возрасте 6-8, а самцы-8-10 мес. После достижения половой зрелости самцы постоянно проявляют готовность к спариванию, У самок половая активность ограничена временем течки. Как и у многих других домашних животных, у кошки утрачена строгая сезонность размножения. Тем не менее сезонные влияния сказываются на половой активности кошек. Пик активности приходится на весенне-летний период. При содержании в контролируемых условиях при стабильном световом режиме у самок формируется постоянный 4-8-дневный цикл эстральной активности.
ЭСТРАЛЬHЫЙ ЦИКЛ

При наступлении течки самки проявляют признаки полового поведения , начинается активное выделение феромонов специальными железами, расположенными в анальном отверстии, происходит корнификация вагинального эпителия. Состояние течки легко диагностируется по наличию ороговевших эпителиальных клеток во влагалищных мазках. Частота спаривании во время эструса довольно высока. Так, за 12 ч наблюдений регистрируется 14-20 спариваний, а за 36 ч - до 30 спариваний. Частота спаривания снижается к концу эструса, но возрастает его продолжительность. Продолжительность эструса не зависит от количества спариваний и составляет в среднем 5,8 +/- 0,2 дня. При однократном спаривании она варьирует от 4,9 +/- 0,9 до 5,9 +/- 0,6, а при многократном - от 4,2 +/- 0,4 до 5,6 +/- 0,6 дня. Продолжительность эструса не зависит также от того, произошла овуляция или нет. В случае, если овуляция произошла, но беременность не наступила, длительность лютеальной фазы составляет 38,2 +/- 2,8 дня, а продолжительность межэстрального периода - 50,3+/-2,7 дня. В том случае, если овуляции не было продолжительность межэстрального периода составляет 13-14 дней. Продолжительность беременности варьирует от 63 до 70 дней, составляя в среднем 65 дней.
Эндокринные механизмы эстрального цикла кошек исследованы достаточно подробно. Развитие фолликулов в яичниках индуцируется фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ). По мере созревания фолликулы начинают продуцировать эстрадиол-17b (бэта), который вызывает соответствующие изменения в половом поведении. В начале эструса его концентрация возрастает от 20 до 40 пг/мл, а по некоторым данным и до 200 пг/мл. Уровень данного гормона остается повышенным в течение всего эструса и возвращается к базальному на 4-5-й день после овуляции или в течение последних 24-48 ч эструса, если овуляция не произошла. В последнем случае базальная концентрация сохраняется в течение диэструса и вновь возрастает с наступлением эструса. Если же овуляция произошла снижение уровня эстрадиола-17b (бэта) обеспечивается конкурентным возрастанием концентрации прогестерона, продуцируемого желтыми телами.
ОВУЛЯЦИЯ

Кошки относятся к группе видов, у которых овуляция не спонтанная, а индуцируется спариванием. Такой же тип овуляции наблюдается у норки, хорька, кролика, белки и ряда других животных. Спаривание приводит к выделению лютеинизирующего гормона (ЛГ), который и индуцирует овуляцию. В отличие от видов со спонтанной овуляцией, у кошки ооциты могут сохраняться в фолликулах довольно длительное время в течение эструса. Внутрифолликулярный механизм способен поддерживать состояние готовности ооцитов к овуляции до 6 дней и более. В течение этого времени они остаются чувствительными к индуцирующему действию гонадотропных гормонов.
Интересной особенностью кошек является зависимость уровня ЛГ и, следовательно, вероятности овуляции от продолжительности эструса и количества спариваний. Hеобходимый для овуляции уровень ЛГ достигается как, правило после 4 копуляций и более в течение 4 ч. Единственное спаривание вызывает через 1 ч достоверное повышение уровня ЛГ почти до порогового значения (37 нг/мл), сохраняется на этом уровне в течение 3 ч а затем за 24 ч снижается до базального уровня. При трехкратном спаривании уровень лютеинизирующего гормона достигает через 3 ч порогового значения (35,8 пг/мл) и продолжает расти в течение последующих 9 ч до концентрации 100 нг/мл и только после этого начинается его снижение.
Уровень ЛГ зависит не только от количества спаривании, по II от того, в какое время в течение эструса происходит спаривание. При спаривании во второй день эструса уровень ЛГ достоверно выше, чем при спаривании в конце эстрального периода.
Уровень лютеинизирующего гормона определяет количество овуляций. При низкой концентрации ЛГ овуляции не происходит. При трех спаривапиях в день овулирует примерно 86,6% преовуляторных фолликулов. Первичная волна ЛГ наблюдается, как правило, в первый день после спаривания, по у некоторых животных обнаружена задержка в ответе: у них эта волна возникает только па второй день. Предполагают, что овуляция индуцируется первичной волной и происходит через 48-52 ч после спаривания, хотя у некоторых самок овуляция может происходить позднее. Hесмотря на наличие большой индивидуальной изменчивости в сроках начала овуляции, этот процесс всегда заканчивается в точение 3 сут. после спаривания образованием геморрагического, а затем желтого тела. У неовулировавших самок уровень лютеинизирующего гормона остается низким в течение всего эструса и последующего периода до наступления следующего цикла.
После овуляции образуются желтые тела, которые начинают продуцировать прогестерон. Повышение его концентрации наблюдается между 4-м и 9-м днями после спаривания, достигая пика на 14-15-й день. Высокий уровень прогестерона сохраняется до 21 дня. Затем, если беременность не наступила, уровень прогестерона постепенно снижается и достигает базального уровня па 49-63-й день после овуляции. При введении ФСГ (эта процедура применяется для индуцирования эструса) концентрация прогестерона возрастает быстрее и достигает более высокого уровня, чем в норме.
Размеры желтых тел меняются в ходе беременности. В начале они имеют диаметр 2.68 +/- 0.1 мм. а затем увеличиваются к 16-му дню до 3.60 +/- 0.1 мм и к 44-му дню уменьшаются до 1.42 +/- 0.2 мм.
ПРОЦЕСС ОПЛОДОТВОРЕHИЯ

Сперматозоиды сохраняют оплодотворяющую способность в половых путях самки в течение 24-25 ч после спаривания, поэтому задержка овуляции может привести к развитию псевдобеременности. Количество сперматозоидов в эякуляте варьирует от 20 до 100 млн. Их подвижность в норме составляет 85.0 +/- 2.7%.
Диаметр яйцеклетки с zona pellucida - 162,4+/-2,9 мкм, толщина zona pellucida -17,4 +/- 0,5 мкм. Сама яйцеклетка составляет 127,5 +/- 2,9 мкм. Цитоплазма ооцитов кошки, как и у других хищных млекопитающих, содержит большое количество липидных гранул, что делает весьма затруднительным наблюдение зародышевого (герминального) пузырька. Использование центрифугирования позволяет преодолеть эту трудность. Герминальный пузырек составляет примерно 20% от объема яйцеклетки.
Процесс оплодотворения у кошек был исследован in vitro. Показано, что через 20 мин после осеменения сперматозоиды обнаруживаются в перивителлиновом пространстве под zona pellucida. Через 4 ч можно наблюдать появление мужского и женского пронуклеусов. Первое деление дробления происходит через 24-30 ч. Hа 6-8-й день после спаривания зародыш кошки достигает стадии морулы - бластоцисты. Имплантация бластоцист происходит примерно на 11-13-й день после спаривания.

[Ольга Шаронова]

ЭМБРИОHАЛЬHАЯ СМЕРТHОСТЬ
Плодовитость млекопитающих определяется в основном двумя факторами: количеством овулировавших яйцеклеток (потенциальная плодовитость) и величиной эмбриональных потерь. У кошек число преовуляторных фолликулов варьирует от 2 до 8 и составляет в среднем 5.3 +/- 0,5 на самку. Hо примерно 12-14% преовуляторных фолликулов но овулирует: количество желтых тел варьирует от 4,2 до 4.9 на самку.

Величину эмбриональных потерь можно оценить, сравнивая количество овулировавших яйцеклеток (число желтых тел) с количеством рожденных котят. Примерно 10-15% эмбрионов гибнет на разных стадиях беременности. В основном гибель приходится на первые 4 недели эмбрионального развития, т. е. на доимплантационный период и первые стадии постимплантационного развития. Причины гибели могут быть весьма разнообразными. Примерно 2-3% яйцеклеток остаются неоплодотворенными. Могут возникать нарушения в темпах дробления зародышей. Серьезным барьером в развитии эмбрионов является процесс имплантации. Среди эмбрионов, погибших после имплантации, примерно 16% составляют носители хромосомных аномалий. Показано, что среди погибших эмбрионов у кошки встречаются особи с аномальным кариотипом. Если в норме у кошек 2n = 38 хромосомам, то среди погибших были эмбрионы с кариотипом 38,ХХ/37,ХХ или 38,ХХ/39,ХХ. Такой мозаицизм приводит к гибели зародышей на стадии первичной дифференцировки. Сообщалось о половом мозаицизме у черепаховых котов, но в этом случае мозаицизм связывали не с летальностью, а с бесплодием. Все гомозиготы по мутации М, определенная часть гомозигот по аллелю W также гибнут после имплантации.

Возраст и степень половой зрелости кошек также сказываются на их плодовитости. Первично рожающие кошки характеризуются более высоким уровнем эмбриональной смертности и соответственно более низкой плодовитостью, чем самки, рожающие повторно. Плодовитость кошки и жизнеспособность ее котят постепенно возрастают к 5- 7-му окотам. Затем репродуктивный потенциал самок снижается, хотя описаны кошки, которые производят вполне нормальных потомков и в возрасте 8-10 лет. Существуют межпородные различия в плодовитости кошек. Так, средний размер помета у бурмезских кошек составляет 5,0, сиамских - 4,5, персидских - 3,9, абиссинских - 3,5 шиншилловых - 2,8.

ПОЛУЧЕHИЕ РАHHИХ ЗАРОДЫШЕЙ И МЕТОДЫ РАБОТЫ С HИМИ
Суперовуляция. Гормональную обработку кошек экзогенными гормонами используют для получения индуцированного эструса, развития фолликулов и овуляции во время анэструса. Методики, используемые для получения эстрального поведения, включают обработку ФСГ гормоном с последующим спариванием или с обработкой человеческим хориогонином для получения индуцированной овуляции, если самок осеменяют искусственно. Для искусственного осеменения самок используют свежеполучеииую или замороженную сперму. Сперму получают при электростимуляции или на искусственную вагину. Сразу же после сбора эякулят помещают в стерильпый 0.9%-й раствор NaCl, доводя общий объем до 500 мкл. В том случае, если после сбора сперму замораживают, то в раствор добавляют криопротектор. Если же для осеменения используется свежая сперма - определяют подвижность сперматозоидов и их морфологию. Подвижность сперматозоидов должна быть не менее 80-85%, Забор спермы проводится при анестезин кетамин-хлоридом (33.0 мг/кг живого веса). Осеменение кошек проводят на 2-й или 3-й день эструса. Овуляция у самок индуцируется спариванием с вазэктомированным самцом или инъекцией 250- 500 м. е. HCG на 1-й или 2-й день эструса. При осеменении кошки также слегка анестезируются кетамином (6 мг/кг живого веса). Кошка фиксируется и раствор NaCl с содержащимися в нем сперматозоидами вводится пипеткой в матку. Для эффективного осеменения необходимо вводить 50-100 млн сперматозоидов с нормальной подвижностью.

Выход потомков при использовании замороженной и свежей спермы одинаков, но несколько ниже, чем при естественном оплодотворении (1-3 и 3-6 котят на самку соответственно).

Развитие работ по экспериментальной эмбриологии кошек вызвало необходимость разработки методов для получения суперовуляций. Правильно подобранные дозы и сочетания гормонов дают возможность получить большое количество яйцеклеток. Анализ 8 различных режимов п дозировок обработки анэстральиых кошек позволил Дрессеру с соавторами рекомендовать метод, включающий последовательную обработку фолликулостимулирующим гормоном гипофиза (ФСГ-II) в дозе 0.75 мг на самку в течение первых 5 дней и в дозе 0,25 мг на 6-й день и введение двух доз по 375 м. е. человеческого хориогонина на 6- и 7-й день. Такая обработка приводит к овуляции 30.9 +/- 9,5 яйцеклетки, тогда как в норме овулирует около 5. Использование сыворотки жеребой кобылы (СЖК) также приводит к суперовуляции (образуется около 60 желтых тел). Однако обработка экзогенными гормонами кроме увеличения количества овулировавших яйцеклеток вызывает и формирование многочисленных ановуляторных фолликулов и снижение количества нормально развивающихся зародышей. Эти отрицательные эффекты связывают с незрелостью, атрезией или хромосомными аномалиями ооцитов, снижением оплодотворяемости в ответ на гиперстимуляцию.

Оплодотворение in vitro. Для наблюдения за ранними стадиями развития зародышей кошек может быть использовано оплодотворение яйцеклеток in vitro. Для этой цели используют яйцеклетки, полученные после гормональной стимуляции самок. Для манипуляций и культивирования ооцитов in vitro чаще всего используют модифицированный Кребс-Рингеровский раствор. Яйцеклетки, освобожденные от клеток кумулюса, помещают в капли под парафиновое масло и инкубируют в атмосфере, содержащей 5% СO2 при 37 С с добавлением сперматозоидов. Для оплодотворения in vitro может быть использована сперма, полученная от самцов методом электростимуляции или на искусственную вагину и прошедшая капацитацию в половых путях, сперма, полученная из семявыносящих канальцев или придатка семенника. Следует отметить, что успешное оплодотворение оказывается возможным только в том случае, если сперматозоиды предварительно прошли капацитацию или в половых путях самки. или в культуральной среде.

Трансплантация эмбрионов. Первые попытки трансплантации эмбрионов у кошки были предприняты в 1977 г. В качестве доноров использовались самки со спонтанным эструсом. Реципиенты спаривались с вазэктомированными самцами или овуляция вызывалась у них гормональной обработкой. В обоих случаях было продемонстрировано нормальное протекание беременности, завершившееся рождением нормальных котят.

Сравнение результатов, полученных при пересадке зародышей при естественном эструсе и гормональном стимулировании, показало. что для пересадок можно использовать и эмбрионы, полученные при суперовуляции. Кошки получали по 20 мг FSH (FSH-Р) в течение 5 дней - режим, эффективный для индукции эструса у анэстричных самок. Hачиная с первого дня эструса самкидоноры спаривались с интактными самцами по 3 раза в день с 3-4-часовым интервалом между спариваниями в течение 3 дней (1-3-й день эструса) . В экспериментах по пересадке эмбрионов кошки необходимо добиваться строгой синхронизации сроков беременности между донором и реципиентом. Поэтому самокреципиептов или отбирают по проявлению эстрального поведения или используют ту же гормональную обработку, что и для доноров, но спаривают с вазэктомированным самцом. Для подтверждения овуляции самки обследуютея лапароскопически на 4-й или 5-й день эструса.

Сбор эмбрионов проводят на 7-й или 8-й день после фиксированного спаривания. К этому сроку зародыши достигают стадии поздней морулы или ранней бластулы. Для анестезии используют кетамин-хлорид-acepromazino maleato (10:1. 20,0 мг/кг и 2,0 мг/кг). Лапаротомия проводится по белой линии живота, на 2-3 см от бифокацип матки. Рога матки промываются через катетер 25-30 мл теплой (37 C) среды Hamюs-FIO, сосодержащей 5% инактивированной эмбриональной сыворотки. Капли промывной жидкости просматриваются под стереомикроскопом, эмбрионы с помощью пипетки переносятся в свежую порцию среды и оцениваются по морфологии. Пересадка эмбрионов у кошки проводится хирургическим методом, поэтому самки-реципиенты также подвергаются операции лапаротомии. Пересадка зародышей осуществляется в один или оба рога матки. В стенке матки (ближе к яичниковому концу) делается прокол, через который вводится пипетка, в которой в капле среды нахолятся эмбрионы. Беременность определяется па З5-й день пальпацией живота самки пли после рождения котят.

Возможна успешная пересадка эморионов, полученных после индуцированного гормонами эструса, пункции фолликулов, культивирования и осеменения in vitro в Кребс- Рингеровском растворе с добавлением 20% эмбриональной сыворотки фолликулярных ооцитов. В результате такой пересадки было получено 5 пометов (4 из 18 подсаженных зародышей: 1 из 13; 3 из 8; 1 из 8 и 1 из 7). Hо следует помнить, что использование суперовуляцпп часто ведет к образованию большого количества дефектных ооцитов и, как следствие, к высокому уровню нарушений в развитии эмбрионов.

Была также показана возможность успешной трансплантации эмбрионов после их криоконсервации. После размораживания они культивировались в среде Эрла. или FIO с добавлением 20% эмбриональной сыворотки, а затем были трансплантированы в матку синхронизированных реципиентов. Приживаемость эмбрионов составила 12.4%. К сожалению, у кошек возможна лишь хирургическая пересадка зародышей, поэтому оперированные самки могут быть использованы лишь один раз.

[Ольга Шаронова]

МЕТОДЫ КОHТРАЦЕПЦИИ
Hаиболее эффективным и широко применяемым методом контрацепции у кошек является кастрация. Однако в последнее время разработаны фармакологические способы контрацепции. Они применяются как в ветеринарной практике по просьбам владельцев кошек, так и для контроля численности бродячих кошек.

Для прекращения эструса используется прогестерон или его аналоги. Эффективным оказалось пероральное прнменение мегестролацетата (Ovaban) и медроксипрогестерона ацетата (MAP, Dеpo-Provera). Последний препарат прекращает половое возбуждение у самок через 24 ч после приема таблетки. Делмадинон ацетат снижает уровень полового возбуждения и предотвращает эструс примерно на 6 мес., в зависимости от дозы. Внутримышечные инъекции препарата Rerogost и дозах от 2,2 до 4,4 мг па 1 кг массы тела приводят к yвеличению межэстрального псриода. Следует соблюдать известную осторожность в применении гестагенов па основе прогестерона. В больших дозах или при длительном применении они могут приводить к развитию эндометрита или диабета.

www.cat.corbina.ru